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IE6-A2细胞【SX1412-D】复苏步骤注意事项:
【材料】1. 常规细胞培养仪器设备 恒温水浴振荡器。 2. 培养液(DMEM)胎牛血清(CBS)二甲基亚砜(DMSO)
【操作程序】 1. 细胞实验室进行常规**,紫外照射40min以上。 2. 培养液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒温水浴箱370C预热20min,备用。 3. 二甲基亚砜(DMSO)在40C冰箱中冷藏30min,备用。 4. 从液氮保存罐中取出冻存管,立即放入400C水浴中,快速摇晃,直至冻存液完全融化。 5. 将细胞悬液移入15ml离心管,缓慢加入4ml培养液,离心(1000r/min,5min)。 6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整细胞浓度,方培养箱中培养。 7. 记录复苏日期。
IE6-A2细胞【SX1412-D】【注意事项】 1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。 2. 冻存液的问题:冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚砜(DMSO)对细胞不是完全无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大,因此,必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤,二甲基亚砜(DMSO)*好选择进口产品。 3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。 4. 离心问题:目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,**天换液。因为离心的目的是两个,去除 DMSO,去除死细胞,这个是标准流程,但对一般人来说,把握不好离心转速和时间,转的不够活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活细胞会受压过大, 死亡。此外在操作过程中容易污染,所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜(DMSO),DMSO对细胞有一定的毒副作用,所以须将离心后的液 体前倒净,且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏,结果无有异常。 5. 细胞贴壁少的问题:教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml-15m培养液,而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。 6. 复苏细胞分装的问题:试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁。 7. 加培养基的量放入问题:这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度,从如果你加培养基的太少,那么DMSO的浓度就会比较大,就会影响 细胞生长,从以前的资料来看,DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响,还有一个说法是1%。所以如果你的冻存液的浓度是 10%DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
IE6-A2细胞【SX1412-D】 一、原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞*易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。 目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。 二、操作步骤 (一)冻存 1、消化细胞(同实验二),将细胞悬液收集至离心管中。 2、1000rpm离心10分钟,弃上清液。 3、沉淀加含保护液的培养,计数,调整至5×106/ml左右。 4、将悬液分至冻存管中,每管1 ml。 5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。 6、贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 7、按下列顺序降温:室温→4℃(20分钟〕→冰箱冷冻室(30分钟)→低温冰箱(-30℃ 1小时)→气态氮(30分钟)→液氮。 注意:操作时应小心,以免液氮**。液氮定期检查,随时补充,**不能挥发干净,一般 30立升的液氮能用1~1.5月。 (二)复苏 1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏,内装2/3杯37℃的温水。 2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。 3、打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中。 4、1000rpm离心10分钟,弃去上清液。 5、沉淀加 10ml培养液,吹打均匀,再离心10分钟,弃上清液。 6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中,37℃培养,**天观察生长情况。 三、试剂和器材 器材:液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机等 试剂:0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基(即冻存液) 附:冻存液配制: 培养基加入甘油或DSMO,使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。
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